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作者：Jerry

导读：在秀丽隐杆线虫(C. elegans )中，程序性细胞死亡的开始以CED-3的激活为标志，这一过程需要CED-4凋亡体的组装。活化的CED-3与CED-4凋亡小体形成全酶，切割多种底物，导致不可逆的细胞死亡。尽管经过数十年的研究，CED-4促进CED-3激活的潜在机制仍然难以捉摸。

近日，清华大学/西湖大学施一公团队在知名期刊《Life Science Alliance》上发表了题为“Structural insights into CED-3 activation”的研究论文，该研究组装了不同的CED-4/CED-3复合物来模拟CED-3的顺序激活阶段，并确定了它们的冷冻电镜结构。除了先前报道的晶体结构中的八聚体外，CED-4单独或与CED-3复合物以多种寡聚态存在。在生化分析的支持下，该研究发现保守的CARD-CARD相互作用促进了CED-3的激活，并且程序性细胞死亡的启动受到CED-4凋亡的动态组织的调节。

https://www.life-science-alliance.org/content/6/9/e202302056

研究背景

01

程序性细胞死亡(Programmed cell death, PCD)又称细胞凋亡，在后生动物中保守存在，在多细胞生物的发育和内环境稳态的维持中起重要作用。凋亡的执行以被称为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)的细胞杀伤蛋白酶的激活为特征，它包括启动剂和效应半胱天冬酶。启动半胱天冬酶可被凋亡细胞等蛋白质机制激活，而效应半胱天冬酶可被启动半胱天冬酶直接切割和激活。这一保守的凋亡途径首先在秀丽隐杆线虫中被发现，其中CED-3 (cell death abnormal, CED)是唯一的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。

CED-3是一种无活性的酶原;其激活要与CED-4凋亡体相关。在发育过程中，秀丽隐杆线虫中的131个细胞被程序化地在特定的时间和特定的位置死亡，导致成虫中的959个细胞死亡。为了启动细胞死亡，EGL-1被转录激活并与CED-9特异性结合。

在CED-4凋亡小体存在的情况下，CED-3在多个位点发生自裂，导致CARD结构域和催化结构域分离，后者包括大亚基和小亚基。低温电镜初步分析表明，CED-3的催化结构域被安置在CED-4细胞凋亡的巢中。CED-3的L2 "环(389-406残基)肽与CED-4凋亡细胞结合的晶体结构揭示了CED-3催化结构域与CED-4之间的特异性相互作用。然而，CED-3和CED-4之间保守的CARD-CARD相互作用的机制尚不清楚。

CED-3活化和活性调控的工作模型

研究过程

02

在这项研究中，研究人员报告了系统的结构和基于结构的生化分析，揭示了CED-3激活的机制。

通过比较不同Ced-4/Ced-3复合物的数据集,研究人员得出结论,不同CED-3区域的存在有可能稳定该复合物的特定低聚物态。那么，CED-4六聚体的功能是什么呢?在CED-3活化实验中，研究人员观察到CED-4凋亡小体在CED-3活化中具有意想不到的抑制作用。这一现象在其它同源物中未见报道。高浓度的六聚体可能会短暂地隔离CED-3单体，从而阻止其二聚化或活化。在这种情况下，研究人员假设CED-4六聚体可能代表了CED-4凋亡体的早熟状态，并有助于调节CED-3的激活。

与哺乳动物同源的Apaf-1凋亡小体通过CARD-CARD相互作用结合4-5个caspase-9分子不同，有报道称CED-4凋亡蛋白与CED-3催化结构域的两个分子结合。CED-3酶原在Asp221后可被裂解，分离出CARD结构域和催化结构域。因此，CED-3催化结构域的其余两个分子可以被其他CED-4分子释放并进一步激活，促进细胞凋亡的发生。

基于最新的结构和生化数据，研究人员提出了一个CED-3的活化模型。CED-4二聚体在CED-9隔离解除后自发组装。然而，大多数可能形成早熟的六聚体。失活的CED-3酶原与CED-4凋亡细胞结合，启动CED-3活化，这一过程需要CARD-CARD相互作用。活化的CED-3获得增强的蛋白酶活性，从而激活更多的CED-3酶原。CED-3催化结构域与CED-4结合形成七聚体或八聚体，其中CED-3表现出增强的蛋白酶活性。

为了进一步了解CED-4对CED-3的激活机制，该研究组装了不同的CED-4/CED-3复合物来模拟CED-3的顺序激活阶段，并确定了它们的冷冻电镜结构。CED-4和CED-3之间的CARD-CARD相互作用在全酶的结构中得到了彻底的表征。

研究意义

03

该研究观察到CED-4凋亡小体和CED-4/CED-3复合物的多种低聚状态，这为CED-4促进CED-3活化的机制提供了前所未有的见解。

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